مرض السرطان ونبات الحلبه

"تحليل احصائي " من مكتب السقيفة الى اهمية علاج نبات الحلبه في السرطان للتواصل +962788038777

موت الخلايا المبرمج المحفز بالحلبة في خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7  بوساطة مستقبلات فاس المستقلة

ملخص

نبات الحلبة (Trigonella foenum graecum) هو نبات عشبي تقليدي يستخدم لعلاج الاضطرابات مثل السكري وارتفاع الكولسترول، والجروح، والالتهابات، وأمراض الجهاز الهضمي، ويعتقد أن له خصائص مضادة للورم، على الرغم من أن آلية هذا النشاط ما زالت يتعين توضيحها. في هذه الدراسة، قمنا بإعداد خلاصة الميثانول من نبات الحلبة الكامل والتحقيق في آلية المشاركة في أثره المثبط لنمو على خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7. FME يقتل بفعالية خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7  من خلال استحثاث موت الخلايا المبرمج. وقد تأكد موت الخلايا المبرمج بواسطة تجارب trypan blue exclusion  واختبارات deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and real-time PCR. تعرضت الخلايا لـ 65 ميكروغرام / مليجرام من FME لمدة 24 ساعة، الأمر الذي أدى في موت مبرمج للخلايا 46.1٪ على التوالي. علاوة على ذلك، نتج عن التعرض لمدة 48 ساعة إلى 65 ميكروغرام / مل من FME إلى موت مبرمج للخلايا بنسبة 58.9٪ على التوالي. وتشير النتائج التي موت الخلايا المبرمج المحفز بـ FME يتم بوساطة مسار مستقبلات الموت كما يدل على ذلك ارتفاع مستوى اضعاف السلسلة في تعبير مستقبلات فاس Fas بعد العلاج بـ FME. ومع ذلك، تم العثور على اضعاف السلسلة لتكون غياب في كاسباس 3، 8، 9، والبروتين p53، وFADD، وباكس وباك Caspase 3, 8, 9, p53, FADD, Bax and Bak  وهو ما أكده بطريقة تعتمد على الوقت وعلى الجرعة، على النحو الذي يحدده اختبار PCR الكمي في الوقت الحقيقي  real-time quantitative PCR. باختصار، هذه المعطيات تدل على أن ما لا يقل عن 90 ٪ من الموت المبرمج للخلايا بوساطة FME في خلايا الثدي تتم بوساطة مستقبلات فاس بشكل مستقل عن FADD, caspase 8 or 3  وبشكل تبادلي مع بروتين p53.

الكلمات الدالة: الحلبة، موت الخلايا المبرمج، سرطان الثدي، التعبير الجيني

مقدمة

على الرغم من التقدم المحرز في علاج السرطان، لا تزال هناك حاجة لاستراتيجيات التدخل، بما في ذلك العوامل الوقائية الكيميائية التي تعمل بمثابة عوامل للدفاع الأولي عن طريق منع أو تأخير أو عكس الآفات السابقة للورم، وكذلك تلك التي تعمل على السرطانات الثانوية أم المتكررة مثل العوامل العلاجية (Kwon KH et al). وقد نجحت الوقاية الكيماوية في العديد من الدراسات المختبرة وكذلك الدراسات التجريبية وتم التحقق من صحتها في العديد من تجارب التدخل البشري (Jeong SL et al). العوامل الوقائية الكيميائية لها آثار جانبية سمية منخفضة وتشارك في تحييد العوامل المسببة للسرطان، فضلا عن تأثيرها على الخلايا (Jie S et al). في السنوات الأخيرة، انصب اهتمام متزايد على تحديد عوامل الوقائية الكيميائية الطبيعية، لا سيما تلك الموجودة في النباتات الطبية والغذائية بسبب المؤثرات الخاصة النشطة بيولوجيا بها (Sebastian KS et al). معظم هذه المواد النشطة بيولوجيا تمارس نشاطها المعالج للسرطان كيميائيا عن طريق عرقلة تقدم دورة الخلية وتحفيز الموت المبرمج للخلية. بالتالي، أصبح تحفيز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية مؤشرا على الاستجابة لعلاج الورم باستخدام النباتات المشتقة من المواد النشطة بيولوجيا وذلك للحد من والسيطرة على الوفيات البشرية بسبب السرطان (Smets LA, Paschka AG et al). وهكذا، فإن هناك حاجة ماسة للبحث عن عوامل بديلة جديدة للوقاية من وعلاج سرطان الثدي.

الحلبة (Trigonella foenum-graecum L.) من المحاصيل البقولية السنوية، ولأن أوراقها لها خصائص علاجية وطبية مذهلة فإنها يتم استخدامها في كثير من أنحاء العالم. إنها واحدة من أقدم النباتات الطبية المعروفة والمعترف بها منذ فترة طويلة في الطب التقليدي في آسيا وأفريقيا ودول البحر الأبيض المتوسط ​​(Naidu MM et al., Mebazaa R et al). وقد أظهرت الأبحاث الحالية على الحلبة أنها تحتوي على مكونات كيميائية فعالة ومفيدة بما في ذلك الساجونينات الستيرويدية steroidal sapogenins  (Taylor WG et al)، والألياف الغذائية (Naidu MM et al)، والجلاكتومانانات  galactomannans (Wu Y etl al)، ومضادات الأكسدة، والأحماض الأمينية مثل  4-hydroxyisoleucineالتي لها خصائص مقاومة للسكري، ومضادات الأكسدة، وخافضة لكولستيرول الدم وسكر الدم والتي يمكن استخدامها كعلاج خافض للحرارة (Bhatia K et al)، ومضادات استقبال الألم، ونشاط المضاد للخصوبة، وعلاج الجذام وإدرار اللبن (Bhalke et al)، وعلاج السمنة والسكري والسرطان (Thomas JE et al).

من هذه العوامل النشطة الديوسجينين، الذي يثبط تكون البؤر الشاذة التي يسببها أزوكسيميثان في الفئران F344 ويحفز الموت المبرمج لالخلايا في خلايا سرطان القولون HT - 29 (Raju J et al). الديوسجينين يمنع أيضا osteoclastogenesis والغزو والانتشار من خلال التنظيم إلى أسفل لعوامل Akt, I kappa B kinase والتعبير الجيني لـ NF kappa B-regulated  في الخلايا السرطانية (Shishodia S et al). وله نشاط مضاد للأكسدة في المرضى الذين يعانون من الخرف للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (Turchan J et al). تم تعريف عامل نشط آخر في الحلبة وهو برووتوديوسين Protodioscin  الذي يحفز موت الخلايا والتغيير المورفولوجي الذي يدل على موت الخلايا المبرمج في خط خلية اللوكيميا H-60 (Hibasami H et al). الجوانب الوقائية الكيميائية تشمل التأثير المحتمل لبذور الحلبة من 7, 12-dimethylbenz[α] anthracene (DMBA) في الفئران (Amin A et al). وقد كشفت بعض المكونات للقلويات، تسمى " trigonelline تريغونيلين"، مما يعني إمكانية استخدامها في علاج السرطان (Bhalke RD et al).

تهدف هذه الدراسة إلى تقييم الإطار العلاجي لاستخلاص الميثانول من نبات الحلبة على خلايا الثدي غير الميتة (خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7). الفحص الكمي النسبي للتعبير الجيني لـ كاسبان 3، 8، 9، والبروتين p53، وفاس، وFADD، وباكس وباك Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax and Bak  في خط خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7  بالعلاج بمستخلص الحلبة التي تم فحصها باختبار RT - PCR.

المواد والأساليب

إعداد المستخلصات النباتية

لقد تم اختيار نبات الحلبة بناء على أساسيات علم الصيدلة العرقية ethanopharmacology. وتم تجفيف كامل النبات في أرضية تحت الظل وتم نقعه في الكلوروفورم لإتمام عملية الاستخراج. تم أخذ كمية من المذيبات بما يساوي 10 أضعاف كمية المواد النباتية. أجري استخراج ثلاث مرات لمدة 24 ساعة. وقد تم تبخير المستخلص المرشح ليتم تجفيفه عند 30 درجة مئوية تحت ضغط منخفض. كذلك تم حل كل 100 ملغ من المستخلص في وسيط 10 مل من مادة DMEM (10٪ FCS) للحصول على مخزون، وتم في المتوسط تمييعه ​​إلى 10، 25، 75، 50 و 100 ميكروغرام / مل (Hasan TN et al, Haraguchi M et al).

صيانة خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7

كان خط خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 هدية عينية من الدكتور M. A. Akbarshah في مركز المهاتما غاندي MGDC، عن بدائل لاستخدام الحيوانات في مجال تعليم علوم الحياة، بجامعة بهارتيداسان بالهند. تم اختبار خط الخلية وجد أنه خال من الميكوبلازما. وقد تم المحافظة على خط الخلية ونشره في 90٪ من وسيط من مادة Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) + أحمر الفينول مكمل بمصل بقري جنيني (FBS) بنسبة 10٪ والبنسلين / الستربتوميسين (100 وحدة/ 0.1 مليجرام) في جو رطب الهواء بنسبة 95 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 35 درجة مئوية. كل الدراسات التي أجريت مع الخلية كانت عند مستوى ثقة يقارب 70 ٪ إلى 80٪. الخلايا المحصودة تعرضت بعد ذلك لتربنة trypsinization موجزة. وتم اختبار سلامة الخلية من خلال اختبار تريبان بلو للاستثناء Trypan Blue exlusion مع تعديل طفيف (James R et al). وكانت سلامة الخلايا أكثر من 95٪.

فحوصات Cell Titer Blue^® للسلامة

تم تنفيذ فحوصات Cell Titer Blue^® (Promega) للسلامة لتقييم سمية التركيزات المختلفة من مستخلص حلبة الكلوروفورم (FME) على خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7. تم إجراء الفحص وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7( 2 × 104 خلية / لوحة) تم وضعها في 96 لوحة وتم معالجتها بـ 0 - 100 ميكروغرام / مل من المستخرج لمدة 24 ساعة. ثم أضيف مباشرة 40 ميكرولتر من مستحضر Cell Titer Blue مباشرة إلى الألواح وتم تحضينه في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. تم تسجيل الومضان مع 560/590 نانومتر (الإثارة / الانبعاث) والترشيح باستخدام قارئ الومضان بيو تيك مايكروبليت (FLx800^TM)، وتم حساب قيمة IC₅₀. تم تشغيل أربعة عينات متطابقة لكل تركيز مستخلص حلبة الكلوروفورم FME في ثلاث تجارب مستقلة.

معالجة مستخلص حلبة الكلوروفورم FME – دراسة مركزة ومعتمدة على الزمن

لدراسة مركزة معتمدة على الزمن، تم معالجة مستخلص حلبة الكلوروفورم FME بـ 50 ميكروغرام / مل كلوروفورم به خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 لمدة 24 ساعة و 48 ساعة لمستحضر dUTP بوسيط deoxynucleotidyl ترانسفيراز " deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP " بوساطة وفحص طريقة nick end labeling (TUNEL). وتم تحضين الخلايا عند نفس تركيز مستخلص حلبة الكلوروفورم FME لمدة 24 و 48 ساعة في الوقت الحقيقي لتحليل PCR الكمي.

فحص TUNEL

تم استخدام مجموعة فحص DeadEnd^® TUNEL (Promega) لدراسة الخلايا بطريقة زمنية تعتمد على الجرعة. تم اتباع إرشادات الشركة المصنعة. باختصار، كانت خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 (1.5 × 10⁶ خلية / لوح) مخزنة في 6 لوحات لدراسة موت الخلايا المبرمج في الخلايا الملتصقة. تم معالجة الخلايا بمستخلص حلبة الكلوروفورم FME بقيمة 65 ميكروغرام / مل لمدة 24 و 48 ساعة. بعد فترة حضانة، تم لفظ العينة، وتم إضافة تريبسين إلى طبقات الخلية. وأعيد ربط الخلايا التي أضيف إليها تريبسين على شرائح بوليليزين مغلفة 0.01٪، مع إضافة الفورمالديهايد خالي الميثانول 4٪، والملون وفقا لبروتوكول لنظام DeadEnd fluorometric TUNEL. وقد لوحظت هذه الخلايا الملونة باستخدام مجهر كارل زايس، (Axiovert) epifluorescence باستخدام مرشح ثلاثي الفرق. لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تظهر موت الخلايا المبرمج، تم إحصاء 1000 خلية في كل تجربة (Shafi G et al).

تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي Real-time quantitative PCR Analysis

تم تحليل التعبير عن جينات الموت المبمرج للخلايا بواسطة اختبار PCR - النسخ العكسي (RT-PCR; Applied Biosystems 7500 Fast)  باستخدام اختبار SYBR Green/ROX للتعبير الجيني في الوقت الحقيقي (QIAGEN). وقد تم مباشرة إعداد [cDNA] من الخلايا المستنبتة باستخدام مجموعة a Fastlane^® Cell cDNA kit (QIAGEN)، ومستويات mRNA من Caspases 3, 8, 9,  p53, Fas, FADD, Bax and Bak ، وكذلك جينات المرجعية  GAPDH، وتم فحصها باستخدام اختبار جينات SYBR Green-based QuantiTect^® Primer (QIAGEN). تم تنفيذ اختبار بي سي آر كمي في الوقت الحقيقي Quantitative real-time RT-PCR  في حجم رد الفعل من 25 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تم إضافة 12.5 ميكرولتر من مزيج كبير، و 2.5 ميكرولتر من الفحص التمهيدي (10×)، و 10 ميكرولتر من قالب [cDNA] (100 ميكروغرام) من كل لوحة. بعد الطرد المركزي القصير، خضعت لوحة PCR إلى 35 دورة بالشروط التالية: تنشيط PCR عند 95 درجة مئوية لمدة 5'، والتمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5" والصلب / التوسيع عند 60 درجة مئوية لمدة 10". تم تشغيل جميع العينات وتشغيلها في ثلاثة أجزاء على نظام اختبار سريع ABI 7500 PCR في الوقت الحقيقي ABI 7500 Fast Real-time PCR. تم تم تحليل بيانات RT - PCR الكمية من خلال طريقة العتبة المقارنة (CT)، وتمت مقارنة العينات التي تم استقراؤها مع العينات غير المعالجة. كما تم استخدام GAPDH كجين مرجعية داخلية لتطبيع التعبير عن جينات الموت المبمرمج للخلايا. تم استخدام دورة Ct لتحديد مستوى التعبير في خلايا السيطرة وخلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 للتعامل مع مستخلص حلبة الكلوروفورم FCE  لمدة 24 و 48 ساعة. ثم تم حساب مستوى التعبير الجيني كما هو موضح سابقا (Yuan JS et al). وتم التعبير عن النتائج كنسبة جين الاشارة إلى نسبة هدف الجينات باستخدام الصيغة التالية: ∆Ct = Ct (apoptotic genes) - Ct (GAPDH). ولتحديد مستويات التعبير النسبية، كانت تستخدم الصيغة التالية: = ∆∆Ct = ∆Ct (treated) - ∆Ct (control). وباختصار، تم التعبير عن مستويات التعبير على أنها الاختلافات بعدد n ضعف بالنسبة للمعير. تم استخدام القيمة لرسم التعبير عن جينات الموت المبرمج للخلايا باستخدام تعبير 2^-∆∆Ct.

النتائج

تحديد سمية مستخلص حلبة الكلوروفورم FME على خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7

تم اختبار تأثير سمية تأثيرات بقيمة من 0 إلى 100 ميكروغرام / مل من تركيز مستخلص مختلف من خلايا حلبة الكلوروفورم FCE  على خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 الخلايا باستخدام خلية فحص Cell Titer Blue^® viability assay (Promega). ولوحظ وجود خفض معتمد على الجرعة في اللون بعد 24 ساعة من العلاج بمستخلص مختلف من حلبة الكلوروفورم FME. باختصار، تم العثور على 71.8٪ من الخلايا ميتة عند تركيز أعلى من اختبار مستخلص حلبة الكلوروفورم FME (100 µg/mL)، في حين أن IC₅₀ من مستخلص حلبة الكلوروفورم FE تحققت عند 53.1 ميكروغرام / مل (الشكل 1).

الحساب الكمي لموت الخلايا المبرمج بواسطة فحص TUNEL

لتحديد ما إذا كان تثبيط تكاثر الخلايا بواسطة مستخلص حلبة الكلوروفورم FME نتيجة استحثاث موت الخلايا المبرمج، استخدم فحص TUNEL. الشكل 2 و 3 يلخصان تأثير مستخلص حلبة الكلوروفورم FME على خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7. ولوحظ وجود زيادة في الجرعة معتمدة على الزمن في استحثاث الخلايا عندما عولجت خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 بمستخلص حلبة الكلوروفورم FME. بالمقارنة مع خلايا السيطرة عند 24 ساعة، تم  معالجة 46.1٪ من الخلايا بـ 65 ميكروغرام / مل من مستخلص حلبة الكلوروفورم FME، خضع بالتالي لموت الخلايا المبرمج. وبالمثل، 58.9٪ من الخلايا عولجت بـ 65 ميكروغرام / مل من مستخلص حلبة الكلوروفورم FME، على التوالي، لمدة 48 ساعة وتعرضت لموت الخلايا المبرمج.

الحساب الكمي لمستويات mRNA من الجينات ذات الصلة بالموت المبرمج للخلايا

للتحقيق في الآلية الجزيئية في مستخلص حلبة الكلوروفورم FME التي تحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 ، تم فحص مستويات التعبير عن الجينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. تم تنفيذ اختبار الكمي نسبي Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax  ومستويات التعبير عن  Bak mRNA، بواسطة اختبار كمي PCR في الوقت الحقيقي (RT - PCR) معتمد على SYBR Green باستخدام 7500 Fast Real Time System (Applied Biosytem).

الشكلان 4 و 5 يلخصان تغييرات التعبير الجيني لاختبار Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax and Bak. في معظم تعبير مستخلص حلبة الكلوروفورم FME زاد نصوص Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax and Bak بعدة أضعاف. وتم معالجة مستويات التعبير عن هذه الجينات في خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 بواسطة 65 ميكروغرام / مل من مستخلص حلبة الكلوروفورم FME لمدة 24 و 48 ساعة بنسبة زيادة على النحو التالي: 0.9 ضعف في كاسباس 3 و 0.25 ضعف في كاسباس 8 و 0.3 ضعف في كاسباس 9 و1.7 ضعف في البروتين p53، و 8.8 ضعف في فاس، و 0.12 ضعف في FADD، و0.4 ضعف في باكس و0.7  ضعف في باك على التوالي بالمقارنة مع المستويات في خلايا السيطرة غير المعالجة. كل هذه البيانات معا تؤيد أن هذه الـ Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax and Bak يتم تحفزيها بواسطة حلبة الكلوروفورم FME بطريقة الجرعة والطريقة المعتمدة على الزمن.

المناقشة

كان الهدف من هذه المقالة تحديد أثر موت الخلايا المبرمج على خط خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7  مع المعالجة بـ FME في تنشيط كاسباس 3، 8، 9 والبروتين p53، وفاس، وFADD، وباكس وباك Caspase 3, 8, 9, p53, Fas, FADD, Bax and Bak. البيانات الواردة في هذه الورقة تظهر تثبيط معتمد على الوقت والجرعة من جانب مستخلص حلبة FME من انتشار خلايا سرطان الثدي من النوع MCF-7 لدى البشر. هناك آليات مختلفة يمكن من خلالها تحفيز موت الخلايا المبرمج في الخلايا مثل التعبير عن البروتينات المؤيدة والمناهضة لموت الخلايا المبرمج. مسارات الموت المبكر لخلايا في الميتوكوندريا ومسارات مستقبلات الموت هما المساران الرئيسيان في خلايا الثدييات. الميتوكوندريا لها دور مركزي في تنظيم سلسلة كاسباس وموت الخلايا المبرمج (Hengartner MO). كاسباس لها دور مركزي في عملية الموت المبرمج للخلايا لأنها تؤدي الى إثار سلسلة من مسارات الموت المبرمج للخاليا (Shah S et al). إطلا السيتوكروم – سي cytochrome-c  من الميتوكوندريا يؤدي إلى تنشيط بروكاسباس -9 ثم كاسباس -3 (Hengartner MO). تنشيط كاسباس 3 خطوة مهمة في مسار الموت المبرمج للخلايا (Earnshaw WC et al). إضافة إلى ذلك، فإن المستجيب كاسباس 3، والبادئ كاسباس 8 و 9، هي الخلايا الرئيسية المنفذة للموت المبرمج للخلايا (Riedl SJ et al). كاسباس 8 هو مستقبل الموت للمسار الذي يوجد فيه كاسباس 9 في مسار الميتوكوندريا، وكلا المسارات يشتركان في كاسباس 3 (Pommier Y et al). كاسباس 8 ينشط الحديث المتبادل بين مسار مستقبل الوفاة ومسار الميتوكوندريا من خلال شطر Bid و tBid، وهما عضوان من عائلة بي سي إل 2 يسببان المت المبرمج للخلايا. تفعيل كاسباس 8 له دور مركزي في الموت المبرمج للخلايا بوساطة فاس. علاوة على ذلك، تبين أن انقسام Bid مرتبط بتنشيط كاسباس 8 (Malik F et al). علاوة على ذلك، فإن باكس وباك هما جزيئان رئيسيان في مسار الميتوكوندريا لموت الخلايا المبرمج، ويتم تنشيطهما بشكل تبادلي بواسطة البروتين p53، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكروم سي cytochrome c  ويليه موت الخلايا المبرمج، والذي قد يكون تنشيط غير مباشر  لـ كاسباس 3 من كاسباس 8 و 9 أو مباشر من كاسباس 9.

ووفقا لمسح أمريكي صدر مؤخرا يقدر أن ما بين 12 ٪ و 17 ٪ استخدموا العلاج بالأعشاب وغالبا ما تستخدم النساء هذه الأدوية كعلاج بديل للعلاج بالهرمونات. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لهذه الأعشاب، إلا أنه لا يعرف إلا القليل عن سلامتها وفعاليتها (Chunyan H et al). إذا ما أخذ هذا في الاعتبار، فإن بيانات GC - MS عن المستخرج الميثانولي من الحلبة تشير إلى أن هناك فئات كبيرة من المركبات مثل الألدهيدات والكيتونات، والأحماض، والكحول، ومركبات الكبريت، والفوران، وmonoterpenes، و sesquiterpenes، والهيدروكربونات العطرية، والتي يمكن استخدامها كعلاج كيميائي أو علاج ضوئي (Mebazaa et al., 2009). الحمض الأميني الفريد من نوعه، 4-hydroxyisoleucine يحفز أداء الأنسولين وبالتالي يسيطر على مستويات السكر في الدم (Gupta, et al., 2001). فهي غنية بالفلافونويد مثل apigenin, luteolin, orientin, quercetin, vitexin and isovitexin  (Blumenthal et al., 2000; Sauvare et al., 2000; Shang et al., 1998). هذه المواد المضادة للأكسدة لها طبيعة تساعد على تقوية جهاز المناعة، وتحسين الصحة الخلوية وتقلل من علامات الشيخوخة (Kaviarasan et al., 2007). بذور التوابل تحتوي 0.1-0.9٪ من مادة ديوسجينين ويتم استخراجها على أساس تجاري. وقد تم تحديد عدة مركبات الكومارين في بذور الحلبة، فضلا عن عدد من أشباه القلويات (على سبيل المثال، trigonelline, gentianine, carpaine)، كما تحتوي على 5.5-7.5 ٪ من الدهون التي تتشكل أساسا من الدهون المحايدة (85 ٪)، يليه الدهون الفوسفاتية (10٪) و والدهون السكرية (5٪). الأحماض غير المشبعة التي تتألف أساسا من اللينوليك (40 ٪)، لينولينيك (25 ٪) والأوليك (14 ٪) تسيطر على الأحماض الدهنية (Baccou et al., 1978; Sulieman et al., 2000).

مركبات N-acylethanolamines وسلائفها، N-acyl phosphatidylethanolamines تم تحديدها على أنها مركبات دهون فوسفاتية في البذور المجففة للأنواع النباتية المختلفة. هذه الدهون تتشكل في مكونات بسيطة في مسار الدهون التي تنظم مجموعة من العمليات الفسيولوجية في النوى متعدد الخلايا بما في ذلك الاستجابة الدفاعية للنبات وتطور الجذور (Chapman, 2004). مركب أوليميد Oleamide عضو مهم في هذه الفئة وهو الدهن الذي يحفز النوم وله تأثيرات متنوعة مثل خصائص مضاد استقبال الألم (تقليل الألم) ويحفز زيادة امتصاص المواد الغذائية (Boger et al., 2004). بعضهم له خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للسرطان وتساعد في السيطرة على العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية في الجهاز التناسلي. مركب Oleoylethanolamine هو منظم ذاتي لتناول الطعام ويقترح كدواء مضاد للسمنة المحتملة (Chatterjee et al., 2010). يعتبر السابوجينين الستيرويدي مركب أساسي في عقاقير الستيرويد مثل الكورتيزون والهرمونات الجنسية (Brenace et al., 1996).

ظهرت عدة مركبات مثل furanones, diosgenin, dioscin  لها نشاط مضاد للسرطان في الفئران، وسرطان الثدي وسرطان القولون. وظهر أيضا أن الديوسين Dioscin يشمل أنشطة مضادة للفطريات، والفيروسات والأورام. في دراسات الخلية كان للديوسين dioscin أثر في الموت المبرمج للخلايا ضد آثار اللوكيميا التي تصيب الإنسان HL-60 وخلايا سرطان عنق الرحم، Caco-2, HCT-116, HepG2, K562 and A-549  (Yum et al., 2010). الديوسجينين أيضا يحفز موت الخلايا المبرمج في التهاب المفاصل الروماتويدي لدى الإنسان، وخط الخلايا العظمية لدى الإنسان 1547، وخلايا سرطان القولون HT-29 التي تصيب الإنسان (Raju J et al)، و خط خلية ابيضاض الدم H-60 بواسطة العديد من المواد المسرطنة في شكل علاج السرطان (Hibasami H et al).

وفقا  Alshatwi et al(بيانات غير منشورة، 2011) يوضح أن بعض المركبات من مستخلص هكسان الحلبة أكثر فعالية في تنشيط مسار الموت المبرمج للخلايا الداخلية وليس الخارجي، الأمر الذي قد يكون راجعا إلى وجود / غياب من المركبات الميثانولية القابلة للذوبان. البيانات الواردة في هذه الدراسة تشير إلى أن موت الخلايا المبرمج المحفز بواسطة FME يتم بوساطة مسار مستقبلات موت الخلايا كما ظهر من خلال زيادة مستوى طيات السلسلة في تعبير مستقبلات فاس بعد العلاج بـ FME والذي يمكن أن يكون بسبب وجود بعض المركبات النباتية phytocompounds في المستخلص الميثانولي وحده. ومع ذلك، وجد أن طيات السلسلة تكون غائبة في Caspase 3, 8, 9, p53, FADD, Bax and Bak.

وبالتالي، يبدو أن هناك مسار موت لخلايا مستقلة مستقبلة لفاس خارجية والتي تحفز العديد من خصائص موت الخلايا المبرمج (الشكل 6). بغض النظر عن الآليات، تظهر بيانات هذه الدراسة أن أقل من 10 ٪ من لايا FME تحفز الموت المبرمج للخلايا اعتمادا على تنشيط كاسباس وتنشيط مستقبلات فاس. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كانت هذه النتائج نفسها تظهر في أنواع الخلايا الأخرى، وخصوصا الخلايا الليفية والخلايا السرطانية.

الخاتمة

في الختام، لقد أثبتنا الملاحظة الحديثة بأن موت الخلايا المبرمج لخلية سرطان الثدي المحفز بواسطة FME يتم بوساطة مستقبلات فاس مستقلة إما بواسطة FADD, caspase 8 or 3 أو بشكل متبادل الاعتماد مع بروتين p53. هذا المسار له دور رئيسي في الموت المبرمج الأولي للخلية في الثدي، وهو ما يمثل أكثر من 90 ٪ من موت الخلايا المبرمج. بما أن تقدم موت الخلية هي آلية موازية ومتميزة ينتج عنها موت الخلايا المبرمج والذي يتشابه مورفولوجيا مع موت الخلايا المبرمج البيوكيميائي ولكن لا تثبطه أي من مثبطات البروتين p53 أو FADD، أو كاسباس 3 و 8 و 9.

ش